在4種維生素E異構體測試過(guò)程中,該如何進(jìn)行鍵合相的選擇?是否遇到過(guò)β-生育酚和γ-生育酚分離不理想、峰形差、柱壓高等問(wèn)題?面臨這些問(wèn)題,我們該如何排查和解決?
首先我們看一下4種維生素E的結構(如圖1.1),對于反相分離模式,我們通常從極性差異來(lái)判斷能否分離,從非極性看,α-生育酚>β-生育酚≈γ-生育酚>δ-生育酚,用常規C18色譜柱,意料之中,β-生育酚和γ-生育酚由于非極性差異太小,不能實(shí)現分離(如圖1.2)。
圖1.1 維生素E結構式
圖1.2 C18分離4種維生素E異構體譜圖
同樣屬于反相分離模式,為什么C30色譜柱可以實(shí)現2種物質(zhì)的分離呢(譜圖見(jiàn)后續二、三、四部分)?
首先我們看下C30色譜柱,和C18色譜柱相比,烷基鏈更長(cháng),由于填料的孔徑都是約為120Å,孔表面鍵合的烷基鏈越長(cháng),不同位置鍵合的烷基鏈交叉重疊的可能性增大,待測組分通過(guò)孔內的阻力增大,C30分離β-生育酚和γ-生育酚依靠的是空間位阻作用。
2.1 流速的影響
色譜條件:
色譜柱:Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553)
柱溫:20℃
流速:0.8ml/min
進(jìn)樣量:10μl
紫外檢測波長(cháng):維生素E為294nm
流動(dòng)相:A:甲醇 B:水
測試結果:
按照GB5009.82-2016第一法中色譜條件,我們發(fā)現β-生育酚拖尾,為了排查β-生育酚拖尾原因,首先嘗試將流速調為0.9ml/min,β-生育酚不拖尾,在27.8min附近多一個(gè)鼓包,干擾α-生育酚的定量,不進(jìn)樣走流動(dòng)相,也有該鼓包,說(shuō)明是流動(dòng)相梯度混合產(chǎn)生的基線(xiàn)波動(dòng),流速為0.8ml/min時(shí),基線(xiàn)鼓包和β-生育酚出峰接近,造成β-生育酚拖尾。繼續增大流速至1.0ml/min,目標物出峰時(shí)間提前,α-生育酚和基線(xiàn)鼓包可以分開(kāi)。
按照GB5009.82-2016第一法中色譜條件,采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553),通過(guò)增大流速,可以避免基線(xiàn)波動(dòng)對目標峰的干擾,另外β/γ-生育酚的分離度也得到改善。具體結果見(jiàn)表2.1。
表2.1 不同流速條件的結果分析
2.2 流動(dòng)相的影響
既然上述條件,β-生育酚“拖尾”是由于梯度程序造成,考慮到整個(gè)梯度程序流動(dòng)相的組成差異很小,我們直接采用甲醇為流動(dòng)相,也可以避免基線(xiàn)鼓包造成的峰形差等干擾。
總結:
該案例中的“峰形差”是梯度流動(dòng)相梯度混合產(chǎn)生的基線(xiàn)波動(dòng)造成的假象,通過(guò)增大流速或者將流動(dòng)相調為甲醇即可解決。
3.1 流速的影響
參考表2.1,增大流速后可以避免基線(xiàn)波動(dòng)對目標峰的干擾,另外β/γ-生育酚的分離度也得到改善。流速是怎么影響β-生育酚和γ-生育酚分離度的呢?還是要從分離度的計算公式來(lái)看,
增大流速后,由于色譜柱和流動(dòng)相種類(lèi)沒(méi)有變化,選擇性α保持不變,由于整個(gè)梯度程序,流動(dòng)相的組成變化不大,所以k變化較小,而β-生育酚和γ-生育酚的柱效提高,所以分離度得到改善。
3.2 柱溫的影響
采用甲醇為流動(dòng)相時(shí),參考2.2中結果,β/γ-生育酚的分離度只有1.55,勉強達到基線(xiàn)分離,我們嘗試將柱溫降低為15℃,β-生育酚和γ-生育酚的分離度明顯得到改善,達到1.90。
柱溫是怎么影響分離度的呢?柱溫的影響相對比較復雜,它對柱效、選擇性和保留因子都有影響,從而對分離度產(chǎn)生影響,這里就不詳細分析柱溫對每個(gè)參數的影響程度了。這個(gè)案例說(shuō)明β/γ-生育酚的分離對柱溫比較敏感,遇到分離度的問(wèn)題時(shí)可以考慮降低柱溫。
總結:
β-生育酚和γ-生育酚分離不理想,梯度條件,可以通過(guò)增大流速解決,甲醇做流動(dòng)相等度條件下,可以通過(guò)降低柱溫解決。
我們發(fā)現,用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm(PN: LAEQ-462552),粒徑從3 μm增大為5 μm,在滿(mǎn)足分離度的前提下,系統壓力更低哦,見(jiàn)表3.1。
表3.1 不同色譜條件下的對比
總結:
采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552),甲醇做流動(dòng)相,可以實(shí)現更優(yōu)的結果,α-生育酚出峰時(shí)間早、β/γ-生育酚分離度好、柱壓更低。
5.1 遇到“峰形差”問(wèn)題,首先排查是否流動(dòng)相的影響,可以通過(guò)空走流動(dòng)相來(lái)確認,該案例中的“峰形差”是梯度流動(dòng)相梯度混合產(chǎn)生的基線(xiàn)波動(dòng)造成的假象,通過(guò)增大流速或者將流動(dòng)相調為甲醇即可解決。
5.2 β-生育酚和γ-生育酚分離不理想,梯度條件,可以通過(guò)增大流速解決,甲醇做流動(dòng)相等度條件下,可以通過(guò)降低柱溫解決。
5.3 采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552),甲醇做流動(dòng)相,可以實(shí)現更優(yōu)的結果,α-生育酚出峰時(shí)間早、β/γ-生育酚分離度好、柱壓更低。
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